构建以CREKA肽修饰的包载多西他赛脂质体(CREKA-lipo-DTX)，评价该药物传递系统体外靶向性和体外抗肿瘤效应。首先采用迈克尔加成反应合成靶向部分DSPE-PEG2000-CREKA，随后使用薄膜水化-超声法制备CREKA-lipo-DTX并对其基本表征进行评价；将PC-3细胞和RWPE-1细胞分别分为3组(n=3)：空白对照组、PEG-lipo-DiI组和CREKA-PEG-DiI组，脂质体与细胞共孵育后，用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分别对脂质体的细胞摄入进行定性和定量的分析，从而评价CREKA修饰脂质体对PC-3细胞的靶向性；将PC-3细胞分为4组(n=3)：空白对照组、游离DTX组、PEG-lipo-DiI组和CREKA-PEG-DiI组，通过CCK-8法和Annexin V/PI双染色法评价该药物载体对PC-3细胞的增殖抑制效应。成功制备出CREKA肽修饰的载药脂质体(CREKA-lipo-DTX), 其粒径为(130.37±1.44)nm，包封率为(91.93±4.64)%。该药物载体稳定性良好，体外释放结果为其具备比较好的缓释性。激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析结果为，与PEG-lipo-DiI组相比，PC-3细胞对CREKA修饰脂质体的摄取明显地增加(P＜0.05)，而RWPE-1细胞对CREKA修饰脂质体的摄取差异无统计学意义(P0.05)；体外抗肿瘤实验结果为，与游离DTX组和PEG-lipo-DTX组相比，CREKA-lipo-DTX组增强了多西他赛对PC-3细胞的杀伤作用(P＜0.05)，而且使PC-3细胞早期凋亡和晚期凋亡的数量均明显地增加(P＜0.05)。结论 成功制备出一种具有长循环和肿瘤特异靶向特性的高效低毒的脂质体载药系统，体外可以特异靶向于PC-3细胞，提高了该载体的体外抗肿瘤效应。

  前列腺癌是男性常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的常见原因之一[1]。虽然局限性前列腺癌能够最终靠手术和放疗得到一定效果的治疗，但是大多数患者会逐渐发展为更具侵袭性的去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)[2]。化疗药物如多西他赛已被大范围的使用在CRPC的治疗[3]，但由于这些药物存在一些难以克服的缺点，如水溶性差、血液半衰期过短、对正常细胞毒副作用大等，仅显示出中等的生存获益，成为限制其化疗效果的一个持续的临床问题[4-5]。因此，更有效的治疗CRPC的替代策略非常有必要探讨。

  近年来，慢慢的变多的研究表明纳米载体在肿瘤的诊断成像、治疗等方面有效[6]。在各种被研究的纳米载体中，脂质体在药物传递领域具有很大的应用前景。脂质体是一种球状结构，由一个或多个围绕离散水空间的同心双脂层形成，脂质体与其他药物输送系统相比存在一些独特的特征，如生物相容性、无免疫原性、自组装能力、能够负荷亲水性和疏水性药物从而改善其溶解性等[7]。为了更好的提高脂质体抗癌药物的疗效，纳米载体常与分子如抗体及其可变片段、肽、核酸适体、维生素和碳水化合物结合从而靶向性将药物递送至癌细胞，达到最大化治疗效果[8]。在癌症进展过程中，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)发生了巨大变化，促进癌细胞迁移和侵袭。在重建的肿瘤ECM中，纤连蛋白(fibronectin，FN)水平上调，以帮助肿瘤生长、进展和侵袭。FN是ECM分子的中心组织者，调节肿瘤微环境与癌细胞之间的相互作用。它的上调与血管生成、癌症进展、转移和耐药性相关[9]。迄今为止，FN靶向制剂已被大范围的应用于肿瘤的诊断与治疗[10]。凝块结合肽半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸(CREKA)是在MMTV-PyMT转基因乳腺癌小鼠体内噬菌体展示中获得的一种FN靶向配体，研究表明CREKA肽能够最终靠与肿瘤血管内的FN和FN相关的凝血血浆蛋白结合靶向于肿瘤部位[11]。

  因此，本研究将CREKA肽作为一种靶向配体，构建以CREKA肽修饰的包载多西他赛的脂质药物传递系统，并初步探讨该药物传递系统体外靶向性和抗肿瘤效应，为进一步开发前列腺癌的靶向治疗制剂提供新的可能性。

  参照文献[12]报道的实验方法，CREKA肽段末端半胱氨酸结构中巯基与DSPE-PEG2000-MAL中PEG链末端的马来酰亚胺基团通过迈克尔加成反应生成DSPE-PEG2000-CREKA。将CREKA肽与DSPE-PEG2000-MAL(摩尔比1.1 :1)分别溶于甲醇和氯仿(体积比1 :1)，少量的三乙胺作为反应的催化剂，该反应在室温下反应12 h。为了进一步纯化合成物DSPE- PEG2000-MAL，将反应后的混合物装进截流分子量3 500的透析袋中，然后在去离子水中透析48 h，最后将纯化好的反应物进行冻干，存储在-20 ℃备用，获得的纯化物通过核磁共振氢谱(1H NMR)进行验证。

  采用薄膜水化-超声法制备脂质体制剂，按照特殊的比例精密称取SPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000-CREKA和DTX，加入适量氯仿溶解，使用旋转蒸发仪在真空条件下去除有机溶剂，圆底烧瓶内壁形成一层脂质薄膜，然后室温下加入PBS缓冲溶液(pH 7.4)对脂质薄膜进行水化，直至薄膜水化完全。涡旋振荡使脂质薄膜分布均匀，再将获得的脂质体悬液在冰水浴中使用探头声震仪超声振荡8 min(150 W，5 s-on/5 s-off)，即得CREKA修饰的包载DTX的脂质体悬液(CREKA-lipo- DTX)。在制备过程中，将DSPE-PEG2000-CREKA换成DSPE-PEG2000，即可得到无CREKA肽修饰的包载DTX脂质体(PEG-lipo-DTX)。

  使用马尔文Nano-ZS90型动态光散射粒径分析仪在25 ℃下测定各脂质体的粒径和粒径分布。取适量各种脂质体悬液，稀释成适宜浓度，置于Zeta样品池中，使用粒径分析仪测定Zeta电位。

  采用超滤法测定脂质体的包封率，精密量取制备好的脂质体悬液0.5 mL两份：一份加入到超滤管中，进行超滤离心10 min，转速14 000 r/min，分离出游离药物和脂质体，取离心流出滤液用HPLC法分析，测定DTX含量，即为未载入脂质体中的DTX质量，记为W游；另一份直接用甲醇溶液破乳，超声10 min，使脂质体完全破裂，测定DTX含量，即为制剂中DTX总量，记为W总。按以下公式计算包封率(EE)。

  通过监测脂质体在50%FBS中的浑浊度变动情况来评价脂质体在血清中的稳定性，将脂质体制剂和FBS按1 :1的比例混合并放在37 ℃下孵育72 h，在不同时间点(0、1、2、4、8、12、24、48和72 h)使用多功能酶标仪在750 nm波长检测混合物的光密度，并计算出相应的透射比，实验重复3次。

  配制含0.5%Tween-80的PBS缓冲液(pH 7.4)作为释放介质，以释放介质为溶剂，配制成质量浓度分别为1、10、25、50、100、200 μg/mL的DTX溶液，按照色谱条件：色谱柱为Hanbon C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、柱温30 ℃、流动相为乙腈-水(体积比50 :50)、检测波长230 nm、流速1.0 mL/min、进样量20 μL，分别进样HPLC分析，记录峰面积，以峰面积(y)对多西他赛质量浓度(x)作线性回归方程，即可得DTX的标准曲线。

  采用动态膜扩散法研究脂质体制剂的体外释放药物性能，用移液器精密吸取CREKA-lipo-DTX、PEG-lipo-DTX、游离DTX溶液各0.5 mL，分别置于分子量8 000~14 000透析袋中，透析袋两端扎紧后置于盛有50 mL释放介质的容器中，置于恒温摇床(37 ℃，120 r/min)振荡，分别于预设时间点0、1、2、4、8、12、24、48 h定量吸取释放介质，并同时补充同温等量相同释放介质，HPLC法测定DTX浓度，计算累计释放率，并绘制药物的体外释放曲线 细胞培养

  实验选取人前列腺癌PC-3细胞，其为雄激素非依赖性前列腺癌细胞，被大范围的使用在雄激素抵抗性型前列腺癌的研究[1]，能够完全满足实验要求，选取人前列腺正常细胞RWPE-1作为正常对照组。PC-3细胞采用F-12K完全培养基(10%FBS和1%的青霉素/链霉素)，RWPE-1细胞采用DMEM完全培养基(10%FBS和1%的青霉素/链霉素)，在37 ℃，5%CO2的培养箱中培养，实验均采用处于对数生长期的细胞。

  为了验证细胞对脂质体的摄入情况，采用细胞膜红色荧光探针DiI作为一种荧光染料代替DTX载入脂质体中进行细胞摄取实验，在激光共聚焦显微镜下观察细胞对不同制剂的摄取情况。将PC-3细胞和RWPE-1细胞按1×105/孔接种于共聚焦专用皿中，在37 ℃、5%CO2环境下孵育24 h，使其完全贴壁，分别加入含PEG-lipo-DiI和CREKA-lipo-DiI的培养基，以只加培养基的细胞作为空白对照组，在37 ℃下继续分别共同孵育2 h。孵育结束后吸出皿中的培养基，用冷PBS缓冲液洗涤细胞3遍，然后在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10 min，固定结束后再用冷PBS缓冲液冲洗细胞，接下来加入DAPI核染色液对细胞核染色10 min，实验中全程避光，最后使用共聚焦显微镜对细胞观察并拍照。

  通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度以对细胞摄取脂质体进行定量分析。将PC-3细胞和RWPE-1细胞按2×105/孔接种于6孔板中，在5%CO2、37 ℃条件下孵育24 h后，分别加入含PEG-lipo-DiI和CREKA- lipo-DiI的培养基，随后在37 ℃继续孵育2 h。孵育结束后吸出孔板中的培养基，用冷PBS缓冲液洗涤细胞3遍，然后加入胰酶消化细胞，待细胞分离后，含血清的完全培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，用0.5 mL PBS缓冲液重悬细胞，该实验中全程避光，最后用流式细胞仪检测并分析，并对细胞的平均荧光强度做多元化的分析，以定量评价细胞摄入脂质体情况。随后又评价了时间对PC-3细胞摄入脂质体的影响，将细胞与脂质体在37 ℃共孵育1、2、4 h，随后用流式细胞仪检测并分析。

  将对数生长期PC-3细胞经胰酶消化后离心重悬、细胞计数板计数，按1×105/孔接种于12孔板中，5%CO2、37 ℃条件下孵育24 h后，在加入脂质体制剂前加入过量游离CREKA肽与PC-3细胞共孵育0.5 h，用培养基清洗细胞，再分别加入含PEG-lipo-DiI和CREKA-lipo-DiI的培养基，以只加培养基的细胞作为空白对照组，随后在37 ℃继续孵育2 h，孵育结束后吸出孔板中的培养基，用冷PBS缓冲液洗涤细胞3遍，然后加入胰酶消化细胞，待细胞分离后，含血清的完全培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，用0.5 mL PBS缓冲液重悬细胞，该实验中全程避光，最后用流式细胞仪检测并分析。

  采用CCK-8法检测各制剂对前列腺癌细胞PC-3的细胞毒性作用。选取处于对数生长期的PC-3细胞，以3×103/孔接种于96孔板中，在37 ℃、5%CO2环境中培养24 h。以完全培养基分别稀释DTX、PEG-lipo-DTX、CREKA-lipo-DTX悬液至浓度为0.1、1、5、10、20 μg/mL，用配制的溶液替换上述96孔的培养基，每个浓度3个复孔，在37 ℃继续培养48 h。每孔加入CCK-8孵育1 h后，使用多功能酶标仪在波长450 nm处测定光密度值[D(450)]，计算细胞存活率。

  细胞凋亡通过Annexin V-PI双染色进行定量分析，PC-3细胞中分别加入相同药物浓度的DTX、PEG-lipo-DTX和CREKA-lipo-DTX制剂，共孵育24 h，孵育结束后吸出孔板中的培养基，用冷PBS缓冲液洗涤细胞3遍，然后加入胰酶消化细胞，待细胞分离后，含血清的完全培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，用0.5 mL PBS缓冲液重悬细胞，分别加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI染液，避光孵育15 min，然后通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

  采用Excel与Graphpad prism软件进行统计学分析，数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准：α=0.05。

  激光共聚焦显微镜观察可见，在相同孵育时间，PC-3细胞中CREKA修饰的脂质体组(CREKA-lipo-DiI)细胞核周围与细胞膜之间的红色荧光信号明显多于非CREKA修饰的脂质体组(PEG-lipo-DiI)，见图 3A；而在RWPE-1细胞中，CREKA-lipo-DiI组与PEG-lipo-DiI组的红色荧光信号无明显差别(图 3B)。说明CREKA肽的修饰提高了PC-3细胞对脂质体的摄取，而对RWPE-1的摄取无明显影响。

  在进行脂质体摄取实验前加入过量游离CREKA肽与PC-3细胞共孵育，对比CREKA-lipo-DiI组与PEG-lipo-DiI组的抑制作用。结果显示，在加入游离CREKA肽后，CREKA-lipo-DiI组的摄取减少具有统计学差别(P＜0.05)，其摄取相当于加入游离CREKA肽前的PEG-lipo-DiI组，而PEG-lipo-DiI组的摄取减少无统计学差别(P0.05，图 4B)。表明CREKA肽修饰的脂质载体的细胞内吞是配体-受体介导的结果。

  对于常规化疗来说，由于非特异性和系统性的药物释放常导致药物快速被清除，需要给予最高耐受剂量的药物。这是不经济的，并且通常表现出高毒性。而肿瘤靶向治疗可以区分正常细胞和肿瘤细胞之间的细微差异，通常比其他常规治疗更有效，并且表现出较少的副作用[14]。脂质体是一种新颖的药物运载工具，通过它可以将药物输送到肿瘤细胞中，同时最大限度地减少药物泄漏到正常细胞中，其与特异性肿瘤生物标记配体的结合能够达到更高效的靶向治疗效果[15-16]。CREKA肽是一种肿瘤靶向肽，可以与FN及FN的复合物结合从而特异性定位于肿瘤部位，已被大范围的应用于前列腺癌的靶向诊断与治疗[17-18]。

  本研究采用脂质体作为纳米载体，CREKA肽作为靶向配体，并装载DTX作为治疗药物，制备一种靶向于前列腺癌细胞的药物传递系统。制备出的脂质体粒径分布均匀，且小于200 nm。这种粒径的脂质体更易于利用肿瘤部位的高通透性和滞留效应在肿瘤部位进行积累从而杀伤肿瘤细胞[19]。对于药物载体系统而言，控制药物释放一直是一个需要非常研究的问题。本实验制备的靶向载药系统拥有非常良好的稳定性，有助于脂质体达到肿瘤部位释放药物，而且制备的脂质体包封率高，可以很好地满足临床需要。通过激光共聚焦显微镜观察发现，在PC-3细胞中，CREKA-lipo-DiI组脂质体的摄入明显多于PEG-lipo-DiI组，而在RWPE-1细胞中，两组无明显差别；同时流式细胞术分析也得出相同的结果。表明CREKA的修饰提高了PC-3细胞对脂质体的摄取量，而对RWPE-1没影响，证实了CREKA-lipo-DiI对PC-3细胞的靶向性。随后竞争抑制实验、流式细胞术分析显示，过量的CREKA肽提前与PC-3细胞的受体相结合，阻断了CREKA-lipo-DiI通过CREKA肽与受体结合介导的内吞作用，因此导致CREKA-lipo-DiI的摄取量明显降低。这表明CREKA肽修饰的脂质载体的细胞内吞是CREKA配体与其受体介导的结果。采用细胞毒性实验和凋亡实验观察该靶向载体体外抗肿瘤效应，结果显示，相较于其他组，CREKA-lipo-DTX组的细胞毒性作用最大。这是由于CREKA-lipo-DTX的靶向作用促进了DTX的递送，提示细胞内药物水平与肿瘤压制效果存在相关性。此外，还对空白脂质体的细胞毒性进行了评估，其细胞存活率一直在95%以上，表明其对细胞的毒性作用可忽略不计。接下来又评估了PC-3细胞的诱导凋亡结果，CREKA-lipo-DTX组诱导凋亡作用最强，作为阳性对照，游离DTX的凋亡率也远小于两载药脂质体组，与细胞毒性结果基本一致。因此，基于CREKA肽修饰脂质体的给药系统对前列腺癌细胞具有特异靶向性及高效的杀伤效应。

  综上所述，本研究成功制备了一种靶向于前列腺癌的脂质载药系统。该系统通过特异性靶向于前列腺癌，可以最大限度将化疗药物递送到肿瘤部位。这不仅仅可以提高化疗药物的治疗效率，还能够降低化疗药物所带来的严重副作用，对改善肿瘤治疗具备极其重大的意义。这将为进一步开发前列腺癌的靶向治疗制剂提供新的可能性。