我们实验室用的银染方法 1.50%甲醇浸泡15 分钟(置于摇摆床上, 以下省略,本步骤两次,每15 分钟更换一次) 2.10% 甲醇浸泡10 分钟 3.水漂洗3 次,每次数秒 4.2μMDTT 溶液浸泡 20 分钟 5.0.1%硝酸银溶液浸泡20 分钟 6.水漂洗3 次,每次不超过15 秒(每次约150ML) 7.显色液漂洗3 次,每次不超过15 秒(每次约100ML) 8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带(约200ML) 9.10G 柠檬酸定影 显色液:15G 无水碳酸钠溶于500ml 水,用前加入250μL搅拌均匀 水用双蒸水就可以,纯度越高越好,其他试剂用分析纯,据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏 此方法出自冷泉港蛋白质技术指南(其实就是其蛋白质技术会议的总结)灵敏度稍低于分子克隆上老方 法,但是十分便捷,也比其他方法快速,只需要1.5 小时,我染出来的胶很美,有需要的话可以上传给大家 看看 一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一 定要洗得很干净。固定、银染之后均需充分的漂洗。 其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。固定时 间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净 大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表 面的蛋白 1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30 秒. 2. 0.1% 硝酸银染色10 分钟. 3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1 分钟. 4.显色液显色15 秒,换用新的显色液,显清条带为止. 显色液配方: 10 克氢氧化钠+0.2 克碳酸钠+2m 甲醛溶液,定溶到500ml. 这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长. 材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。 液体的量一般是胶体积的5 倍，比如13×13×0.1cm 的胶，用一百ml 一定够，80 也行。 我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30 秒三次， 2.0.1% 硝酸银染色10 分钟. 3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1 分钟（换2 次去离子水） 4.显色液显色15 秒,换用新的显色液,显清条带为止.别妄图将所有的条带都显出来， 要求越高可能会引起背 景就深， 5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色， 6. 固定3 分钟后再用去离子水洗涤2 遍（整个试验比较费去离子水）。 我的做法是这样的，染色效果还可以 10%的乙醇固定10 分钟，ddH2O 洗一次， 2 分钟。 1%的硝酸脱色4 分钟，ddH2O 洗两次，每次 1 分钟。 0.2%AgNO3 染色20 分钟，ddH2O 洗三次，每次 1 分钟。 NaCO3-甲醛显色至条带出现。 我的感觉是乙醇和硝酸重复使用的次数不要太多，这样效果不好，NaCO3-甲醛得质量很关键，我们有一次 换了试剂，效果很差 银染法分以下几个程序： 1、固定 2、敏化 3、银育 4 、显影 5、停显 此外，其间还有数步的漂洗程序。 在你的银染方法中没有敏化过程，不过也中可以的，只是灵敏度会下降。 银染法还可分为碱性银染和酸性银染法， 为何称为酸法？是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名？ 何为二胺类银染法？俺知道有银铵法，即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠，银离子在氢氧化钠的作用下生成 氢氧化银沉淀，后加入过量氨水，形成可溶的银铵络和物，而后者经甲醛还原为单质银颗粒。二胺法可是 指此络和物为二铵盐？您这里的“胺”应为“铵”。 至于敏化作用，众说纷纭，且银染的灵敏度相当高，对常规分子生物学实验已是牛刀小用，敏化俺认为还 是不用的好，因为对背景不利。 对于银染的研究在80 年代的electrophoresis 杂志中多有报道。 小经验：为便于控制显影速度，得到最佳的信噪比，银染的显影液温度不要过高，以 10 度左右为宜，高则 易显影过度，背景深，低则显影时间长。 请兔子兄将您的大作上传，大家学习学习。 有人建议在显色液中加0.02% 的硫代硫酸钠来降低背景，我还未实践，不知牛兄和兔兄有无此经验？ 还有灌胶用的玻璃板是不是已经洗干净。 染色液:1g 硝酸银、1 升水 显影液：20g 氢氧化钠、0.4g 碳酸钠、4ml 甲醛、1 升水 步骤：1、将要染的胶板用水清洗10—15s 2 、放入染色液中摇床轻摇8—10min 3、用水清洗10—15s，再加入少许显影液摇10—15s 4 、放入显影液中摇床轻摇5min 左右直至条带清晰。 此种方法染出的胶底色淡黄，带清晰。不足之处就是不易保存，在胶干透之前最好拍照或扫描。 固定: １０% 乙醇+ ０. ５%冰醋酸 ３分钟 染色: ０. ２% ＡgNO3 + 10% 乙醇+0.5% 冰醋酸 12 分钟 清水漂洗 10-15s 显色： 3% NaOH + 0.5% 甲醛（用时加）10min 左右 对比以后觉得比那个用Na2CO3 显色的方法好多了，无论是花费的时间还是银染的效果。呵，传张胶 的照片佐证啊！顺便请教一下各位，为什么我跑电泳的时候靠近电极的一端总是比另一端慢呢？电压太高？ 你这样显色是不规范的， 具体显色步骤如下： 1.2.5.3 银染 （1）固定：将粘胶的玻璃板（胶面向上）置于固定/终止液（10%冰醋酸溶液），振荡20 分钟左右至 指示剂颜色脱掉为止。 （2 ）清洗：用蒸馏水振荡洗涤凝胶3 次，每次5 分钟，凝胶板从水中取出后，竖直控水15 秒。 （3 ）染色：将胶板移至染色液（1gAgNO 溶于1L 水，加入37 ％甲醛1.5ml （用时加）），轻摇35 3 分钟。 （4 ）显影：将染色后的凝胶板放入蒸馏水中2-3 秒，迅速取出并竖直控水，随后把胶板放入预冷的显 影液中（30g 无水Na CO 溶于1L 水中，放在4 ℃预冷，使用时加入1.5ml 37％甲醛和200ul 硫代硫酸钠 2 3 （10mg/ml））。振荡显影至条带颜色深浅合适。 （5 ）定影：将胶板放入第一步反应的固定/终止液中，轻摇7-8 分钟。 （6 ）清洗：用蒸馏水清洗几分钟，取出晾干。 （7 ）扫描胶，找出差异带，并进行条带统计 甲醛在银染当中的作用，求教各位大侠 在此发表自己的一点拙见： １，关于甲醛在银染中的作用： 在显色步骤（developing) 中：甲醛的作用是充当还原剂，反应式如下： ＨＣＨＯ＋２ＯＨ- ——ＨＣＯＯＨ＋Ｈ2 Ｏ＋２e-，失电子而Ａg+得电子 在银染步骤中（impregnation) 中，其作用主要是增敏 原理偶不是很清楚，应该是加速与蛋白质结合的Ａg+的还原。 有文献讲到过 （很老的了，找不到了，应该是ELECTROPHORESIS 上８０年代的文章，上世纪），低浓度 甲醛与蛋白质的结合是可逆的，其并不阻止蛋白质氨基酸残基与Ａg+结合；而高浓度甲醛与蛋白质的结合 不可逆，而且造成蛋白质广范围交联 （是不是有点类似于戊二醛？），并抑制 Ag+与蛋白质的结合，同时 甲醛不能被释放开来用于还原。 至于究竟具体是什么机制造成与质谱不兼容，偶也不知道 （不好意思的说） 想说的一点是，既然两种方法都已经证明optimized for maldi-tof ，那么应都没问题，如果您还有狐疑， 那么，用amersham 的方法吧，毕竟人的心态都更倾向于保险 硫代硫酸钠：增敏时形成潜像 硝酸银：形成显色的像素点 甲醛：还原剂，将银离子还原为零价银。 终止液：一种配方中的EDTA 将银螯合，另一种配方的HAc 改变pH，使甲醛在酸性pH 下的还原能力降低， （个人经验：HAc 终止反应不是很彻底，有一次我用HAc 终止反应，但没有更换 buffer，结果过夜放置后 胶变黑了） 一点看法，抛砖引玉。 一个高灵敏度的质谱相容性银染法 这种方法不用戊二醛，所以是质谱相容的，而且由于甲醛用量很低，其质谱相容性高于其它的相容性 银染方法；灵敏度可以与双胺法银染相近，但比双胺法稳定，基本上没有负染现象，值得一试！ for 1mm SDS PAGE ： 固定：50% 甲醇，5%乙酸 20min 醇洗：50% 甲醇 10min 水洗：ddH2O 10min 敏化：0.02%硫代硫酸钠 1min 水洗：ddH2O 2×1min 银染：冰冷的0.1%AgNO3 20min （4 ℃） （我是把它扔到冰箱里染的） 水洗：ddH2O 2× 1min 显影：0.04% 37% 甲醛，2%无水碳酸钠 显影至蛋白点清晰 这一步要注意在液体变黄时按时换新鲜的溶液，一般要换四次左右，头几次很快，第一次可能只要 几秒就黄了 停显：5%乙酸 保存：1%乙酸 对于1.5mm 的胶： 固定：50% 甲醇，5%乙酸 20min 醇洗：50% 甲醇 10min 水洗：ddH2O 2× 10min 敏化：0.02%硫代硫酸钠 2min 水洗：ddH2O 3×1min 银染：冰冷的0.1%AgNO3 30min （4 ℃） （我是把它扔到冰箱里染的） 水洗：ddH2O 3× 1min 显影：0.04% 37% 甲醛，2%无水碳酸钠 显影至蛋白点清晰 约十分钟，期间注意及更换新鲜溶液， 保持溶液不变黄！ 停显：5%乙酸 保存：1%乙酸 除了银染外，全过程均需摇动。 是我用过最好的银染法，我用过双胺法，安玛西亚的方法，还有其它 的一些，安玛西亚的方法加戊二 醛时的灵敏度只与此方法相当，约为考染的 50 －100 倍，胶体考染的10 倍，锌负染的两倍。 希望我们大家都能重视它，多试多使用 我们实验银染的方法很简单，好象大家做的效果都很好！你也能试试。 1.50%的甲醇摇30 分钟 2 。5%的甲醇摇10 分钟 3.用水快速洗3 次 4.用10 uMde DTT 浸泡20 分钟 5.用0.1% 的AgNO3 浸泡20 分钟 6.用水快速洗1 次。用显影液（取15g 的无水Naco3，溶于500ml 水中，临用前加250uml 的37%的 甲醛）洗2 次，每次不超过15 秒。 7.在显影液中浸泡数分钟，直至蛋白带出现。 8.加柠檬酸终止 我用的是这种方法： 1. Fix gel in 50% MeOH, 5% HAc for 20 mins. 2. Wash gel in 50% MeOH for 10 mins. 3. Wash gel in H2O for 2 hrs. Additional washing over night will reduce background staining. 4. Sensitize gel in 0.02% Na2S2O3 for 1 min. 5. Wash gel in H2O for 1 min. 6. Wash gel in H2O for 1 min. 7. Incubate gel in cold 0.1% AgNO3 for 20 mins. 8. Wash gel in H2O for 1 min. 9. Change gel chamber 10. Wash the gel in H2O for 1 min. 11. Develop gel in 0.04% formalin, 2% Na2CO3 Observe the color and change solution when the developer turns yellow. Terminate when the staining is sufficient. 12. Terminate staining in 5% HAc Change the solution a couple of times 13. Leave the gel at 4ºC in 1% HAc 前１，２，３步的时间能延长或者缩短． 我觉得以前失败的原因可能是没有掌握水洗的时间，以及与水的纯度可能有关 我也做过两次,效果不好.虽然有带,但带感觉是透明的,孔道和背景是暗的.楼主,祝贺你!多指教呀! 水的质量非常重要的，不然背景会很深的，银染时间太长的话，背景也会很深。而且水洗

  2024年企业人力资源管理师之二级人力资源管理师模拟考试试卷A卷含答案完整版720780578.pdf

  2024年检验类之临床医学检验技术(师)全真模拟考试试卷B卷含答案优质 完整版720844645.pdf

  2024年四川省成都市第七中学初中学校中考一模物理试题(解析版).pdf

  2024年二级建造师之二建水利水电实务过关检测试卷B卷附答案 .pdf

  2024年教师资格之中学思想品德学科知识与教学能力综合检测试卷A卷含完整版720848701.pdf

  2024年教师信息技术2.0教研组研修计划(优秀模板6篇)(6) .pdf

  2024年心理咨询师之心理咨询师基础知识通关提分题库及完整答案完整版720794806.pdf

  2024年消防设施操作员之消防设施初级技能题库附答案(典型题).pdf

  电力建设土建工程-施工、试验及验收标准表式--第1部分--施工.doc

  北京市西城区2023-2024学年七年级上学期期末生物试题(无答案).docx

  原创力文档创建于2008年，本站为文档C2C交易模式，即用户上传的文档直接分享给其他用户（可下载、阅读），本站只是中间服务平台，本站所有文档下载所得的收益归上传人所有。原创力文档是网络服务平台方，若您的权利被侵害，请发链接和相关诉求至 电线) ，上传者