本发明专利技术涉及一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法。试剂盒包括：偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；带高正电荷的荧光蛋白；缓冲液。本发明专利技术还涉及上述试剂盒的制备方法。本发明专利技术所述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，无需抗体吸附包被酶标板，且无抗原抗体结合后的洗涤等繁琐步骤，能轻松实现均相体系中目的蛋白聚糖的快速检测分析，灵敏度高。

  本专利技术涉及一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法，属于生物分析和医学检测

  蛋白聚糖(proteoglycan，PG)是一类复杂的生物大分子，在核心蛋白上共价偶联着一条或多条糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)链。GAG是由重复的二糖单位组成的直链多糖，大致上可以分为四类：透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)/硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)及肝素(Hep)/硫酸乙酰肝素(HS)。其中透明质酸不与核心蛋白结合组成蛋白聚糖。蛋白聚糖除含糖胺聚糖链外，还偶联一些N-或O-链接的寡糖链。PG在细胞外基质中广泛分布，也存在于细胞表面以及细胞内的分泌颗粒中。在机体中PG参与了众多生理学过程，如作为组织架构的构成原件存在，调控细胞的增殖、粘附、迁移和变异等过程，还参与生长因子、细胞因子的结合，细胞的信号转导，神经元的生长和形态发生等过程。在癌变微环境中，PG的表达显著改变，因此一部分蛋白聚糖被用作检测某些疾病的特异性标志分子，如蛋白聚糖Glypican的家族成员之一Glypican-3(GPC3)，目前被一致认为是肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的特异性标志分子。GPC3由单链核心蛋白、硫酸乙酰肝素(HeparinSulfate，HS)链和糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)组成，通过GPI锚定于细胞膜上。GPC3在75％的HCC中显著表达，但在肝脏正常组织和良性病变中并不表达，因此是比甲胎球蛋白更为特异和灵敏的新型HCC标志分子。由于蛋白聚糖核心蛋白分子量的大小及其结构不同，且共价偶联的GAG链的数量、种类、长度、硫酸化程度及偶联部位不同，使得蛋白聚糖组成复杂，结构多样，因而给其检测带来了诸多困难。在GPC3的检测中，目前最常用的检测的新方法为夹心ELISA法，但其检验测试灵敏度偏低，只能检测到50％左右HCC病人血清中有明显GPC3存在；且由于第一抗体在酶标板上的吸附包被及第二抗体与抗原的结合需要孵育过夜，完成一次实验需要三天时间，耗时较长，这极大的限制了此方法的应用，给GPC3的检测带来了困难。

  本专利技术针对现存技术的不足，提供一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法。该试剂盒可运用耦联抗体的石墨烯与GPC3核心蛋白的结合，对结合在GPC3HS侧链上的ScGFP的荧光淬灭作用达到对血清/血浆中HCC的标志物GPC3的高灵敏度快速检测。一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，包括：偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；偶联单克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；带高正电荷的荧光蛋白；缓冲液：含有浓度5～50mMTris-HCl和浓度50～200mMNaCl的溶液。根据本专利技术优选的，所述蛋白聚糖为GPC3、GPC1、GPC2、GPC4、GPC5、GPC6、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、Versican、Aggrecan、Brevican、Decorin、Lumican、Perleacan、Agrin、CD44或NG2；进一步优选的，所述的蛋白聚糖为GPC3或蛋白聚糖Syndecan-2；最优的，所述蛋白聚糖为GPC3时，羧基端氨基酸序列长度为50～90个氨基酸，氨基端氨基酸序列长度为490～530个氨基酸。根据本专利技术优选的，所述偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。根据本专利技术优选的，所述偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。根据本专利技术优选的，所述偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。根据本专利技术优选的，所述偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。根据本专利技术优选的，所述带高正电荷的荧光蛋白的浓度为0.001～0.01μg/μL；进一步优选的，所述的带高正电荷荧光蛋白为高正电荷绿色荧光蛋白(ScGFP)。根据本专利技术优选的，还包括装配试剂盒必须的微孔板、锡箔纸。上述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒的制备方法，步骤如下：(1)将单克隆抗体1加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯；将单克隆抗体2加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯；将多克隆抗体3加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯；和/或，将多克隆抗体4加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯；(2)制备带高正电荷荧光蛋白，配制带高正电荷荧光蛋白溶液；(3)配制含有浓度5～50mMTris-HCl和浓度50～200mMNaCl的溶液，制得缓冲液；(4)分别将步骤(1)制得的偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯、步骤(1)制得的偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯、步骤(2)制得的带高正电荷荧光蛋白溶液和步骤(3)制得的缓冲液经装配后，制得用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，表面活性剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或十二烷基磺酸钠(SDS)，每毫升反应体系加入表面活性剂1～5μL；封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)，反应体系中加入封闭剂至质量浓度为0.5％～2％。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，所述羧基石墨烯的反应质量浓度为0.8～1.2mg/mL，羧基石墨烯与单克隆抗体1的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与单克隆抗体2的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与多克隆抗体3的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与多克隆抗体4的反应质量浓度比为10：1。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，单克隆抗体1的制备方法如下：(i)蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列的表达基因插入PTRACER真核表达载体(购自INVITROGEN)，转染HEK293细胞(购自上海细胞所)，从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至1.0～2.0mg/mL，制得抗

  一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，包括：偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；偶联单克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；带高正电荷的荧光蛋白；缓冲液：含有浓度5～50mM Tris‑HCl和浓度50～200mM NaCl的溶液。

  偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；偶联单克隆抗体的

  羧基石墨烯包括：偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋

  白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述

  单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联

  多克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白

  聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体4的羧基

  石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得

  2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是，所述蛋白聚糖为GPC3、GPC1、GPC2、

  白聚糖为GPC3或蛋白聚糖Syndecan-2；最优的，所述蛋白聚糖为GPC3时，羧基端氨基酸

  序列长度为50～90个氨基酸，氨基端氨基酸序列长度为490～530个氨基酸。

  3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是，所述偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯的

  优选的，所述带高正电荷的荧光蛋白的浓度为0.001～0.01μg/μL；进一步优选的，所述

  4.权利要求1所述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒的制备方法，其特征是，步

  (1)将单克隆抗体1加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性

  剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯；

  将单克隆抗体2加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，

  再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯；

  将多克隆抗体3加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，

  再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯；

  将多克隆抗体4加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，

  再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯；

  (4)分别将步骤(1)制得的偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯、步骤(1)制得的偶联

  单克隆抗体2的羧基石墨烯、步骤(2)制得的带高正电荷荧光蛋白溶液和步骤(3)制得的

  5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述步骤(1)中，表面活性剂为乙二

  胺四乙酸(EDTA)或十二烷基磺酸钠(SDS)，每毫升反应体系加入表面活性剂1～5μL；

  封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)，反应体系中加入封闭剂至质量浓度为0.5％～2％。

  6.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述步骤(1)中，所述羧基石墨烯的

  反应质量浓度为0.8～1.2mg/mL，羧基石墨烯与单克隆抗体1的反应质量浓度比为10：1，

  羧基石墨烯与单克隆抗体2的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与多克隆抗体3的反应

  质量浓度比为10:1，羧基石墨烯与多克隆抗4的反应质量浓度比为10:1。

  7.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述步骤(1)中，单克隆抗体1的制

  (i)蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端50～90个氨基酸序列的表达基因插入PTRACER真

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