用LEICA EG 1160自动包埋机进行石蜡包埋。脾脏是细胞密集的结构，切片过厚将影响观察效果。用LEICA RM 2235轮转式石蜡切片机切片，厚度为4µm，切片用烤箱50 oC烘干。

  用LEICA AUTO STAINER XL自动染色机进行HE染色。不同的固定液处理的组织切片在HE染色中，苏木精和伊红的染色及分色时间不一样，染色中通过随时镜检，优化每一种固定液处理的组织切片的最佳的染色时间，获得每种固定液处理的组织切片最佳染色标本。具体步骤如下。

  根据不同固定液的要求，采取不同的固定后处理。中性固定后流水冲洗12 h，蒸馏水洗。Bouin固定的组织直接用70%乙醇，去除固定液中苦味酸的黄色。Helly固定的组织流水冲洗12 h，除去固定液中重铬酸钾后蒸馏水洗。

  用LEICA ASP 300自动脱水机将所有的固定后的组织常规脱水、透明。注意严控无水乙醇、二甲苯和浸蜡时间，防止组织变硬变脆影响切片效果。具体步骤：用70%乙醇、80%乙醇、 90%乙醇、95%乙醇脱水各3 h，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水各2 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各20 min，石蜡Ⅰ，石蜡Ⅱ浸蜡各40 min。

  [4]何春燕,王伟然.、酒精、冰醋酸混合液与常规的固定液固定病理切片标本的效果比较[J].广东医学院学报,1997,15(2):192.

  [5]王正义,柏戒,王亚平.固定液对恒冷箱切片组织架构与染色效果的比较观察[J].重庆医科大学学报,1999,24(1):64-65.

  [6]龚志锦,詹镕洲.病理组织制片和染色技术[M].上海:科学技术出版社,1994:32-36.

  获得理想的脾石蜡切片HE染色切片的方法：大鼠经麻醉、颈总动脉放血，标本经Helly固定液固定，常规脱水、透明、包埋，石蜡切片4µm，HE染色Ehrlich苏木精染色15 min；盐酸酒精溶液分色35 s；伊红染色10 min；90%乙醇分色40 s，可获得较理想的脾石蜡切片HE染色标本。

  ⑴中性固定的组织切片：Ehrlich苏木精染色15 min；盐酸酒精溶液分色35 s；伊红染色10 min；90%乙醇分色40 s。

  组织固定的作用在于使蛋白变性、凝固、沉淀,保持细胞、组织原有的形态[6]。固定是制作脾石蜡切片标本的关键环节，固定液中的化学成分的渗透力，PH值，渗透压，固定时间等诸多因素影响固定液的固定效果[7]。所以最终选择最佳的固定液将会直接影响标本的质量和染色结果。经三种不同的固定液处理的大鼠脾石蜡切片HE染色标本的染色效果各有不同，各有其优缺点：中性固定液：是实验室常规试剂[8]，配制简单易行。但由于固定液中化学成分的渗透压等问题导致结构破损，使切片出现非常明显的皲裂现象[9]；Bouin固定液：亦为实验室常规固定液，配制简单易行，此固定液是由甲醛、苦味酸和醋酸按特殊的比例混合而成, 苦味酸和醋酸配合使用能很好的保存组织架构，因此固定的标本组织架构完整。但染色不及其它两种固定方法染色理想，细胞核与细胞质对比强度不明显[10]；Helly固定液：此固定液主要成分是氯化汞和重铬酸钾，甲醛等，氯化汞使组织硬化快，对细胞核和胞质固定良好，并促进染色，重铬酸钾常用于混合固定液中，有助于组织染色[2]。所以经此固定液固定的组织架构完整，清晰，染色鲜艳，细胞核与细胞质染色对比度好，为制作脾石蜡切片标本理想的固定液。但此固定液配制较复杂,且固定后需去除组织内的重铬酸钾和“汞色素”，步骤较复杂。且此固定液中氯化汞属于剧毒药品，管理要严格，废液需要妥善处理，避免环境污染。

  【作者单位】首都医科大学组胚教研室,北京100069;首都医科大学组胚教研室,北京100069;首都医科大学组胚教研室,北京100069;首都医科大学组胚教研室,北京100069;首都医科大学组胚教研室,北京100069

  [7]赵荧,唐军民,孙海梅,等.形态学实验技术[M].北京:北京大学医学出版社,2008.

  [8]王阿力,王兴海,石瑾,等.使用固定液的几个问题及解决办法[J].解剖学杂志,1997,20(6):613.

  [9]宋容.新配方淋巴结固定液在HE制片中的应用探讨[J].检验医学与临床,2005,2(3):114.

  [2]杨群,胥维勇,何娟,等.不同固定液冷冻切片HE染色质量的对比观察[J].实用医院临床杂志,2010,7(3):69-70.

  表1 不同固定液对大鼠脾石蜡切片HE染色结果的比较固定液 组织架构 染色效果 核质对比度中性固定液[图1]结构不完整，出现非常明显的皲裂现象，产生人工假象 染色较鲜艳 对显而易见Bouin固定液[图2] 结构完整，清晰 染色不佳 对比不明显Helly固定液[图3] 结构完整，清晰 染色鲜艳 对比清晰

  大鼠经麻醉，剪断颈总动脉放血处死，以减少脾内多余的血液成分。为保持脾结构的完整性，取材时应格外小心，最好能够降低金属器械触碰脾实质，用镊子夹持脾周围的结缔组织，小心剥离剔除脾周围多余组织，切取一块近似等边三角形组织块，厚度为5～7 mm，迅速投入固定液中。选择正真适合的固定液是制作良好脾标本的关键。对此尝试以下常规固定液[3]：中性固定液，固定时间为24 h。Bouin固定液，固定时间为24 h。Helly固定液，固定12 h。

  脾脏是哺乳动物体内最大的淋巴器官，富含血管和血窦等。虽为实质性器官，但制作脾石蜡切片难度较大，每一个操作步骤均可影响最终的标本质量。其中固定液的选择特别的重要，直接影响最终的标本染色效果[1-2]。

  用LEICA Q550IW图像分析系统对3种不同的固定液处理的大鼠脾组织石蜡切片染色结果进行显微镜下观察（染色结果见图1、2、3），并从以下方面做比较[4-5]，见表1。